La secuela de El Profesor Layton y la Villa Misteriosa incluirá más de 150 puzzles, y la posibilidad de desbloquear más a través de Nintendo Wi-Fi, además de un puzzle adicional para los poseedores de El Profesor Layton y la Villa Misteriosa.
Esta vez, el profesor y su ayudante Luke deberán investigar la muerte del Doctor Schrader. mentor del Profesor Layton.